于不同荧光分子的光谱重叠!一般只能同时使用O种不同传统的研究方法要经过富集%分离分类和鉴定步骤!耗时长!

　　荧光原位杂交技术及其在环境微生物学中的应用寡核苷酸探针显微探测细菌以来!随着安全性较强的荧光技术的发/01’*2首次应用荧光标记寡核苷酸探针探测独立的微生物细胞!此项技术即荧光原位杂交技术3456’+0780*9ABCDE!通过在环境样品上直接原位杂交!既可测定不可培养微生物的形态特征及丰度!又可原位分析其空间及数量分布!由于ABCD具有测定过程不破坏细胞及其形状特异性强分辨率高安全快速等优点!正在环境微生物领域中逐渐被广泛应用#ABCD技术简介ABCD技术的原理和优点ABCD3456’+0780*9&*:7=+&&?)9&’*E是一种重要的非放射性原位杂交技术!其利用核糖体内长度适中$约!GHH=I%&高度保序列作为理想的基因分类靶序列!根据JLC序列的保守性和特异性设计所需要的不同分类级别的寡核苷酸探针!识别特异核苷酸序列的带标记的一段单链/-.同源互补!经变性’退火’复性形成靶/-.与核酸探针的杂交体#ABCD中使用的JLC寡核苷酸探针!一般是进行了荧光标记的MH=I左右特异性核苷酸片段!利用该报告分子$如生物素&地高辛%与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应!经荧光检测系统对待测行定性&定量或相对定位分析#ABCD技术作为一种非放射性检测体系!具有如下优点($!%ABCD采用非放射性的生物素标记探针!不存在辐射型污染问题#年内使用!且只要具有荧光显微镜!一般常规的实验室均可进行#该技术基于抗体&抗原鉴特异性识别与结合等特点!实验周期短&特异性好&灵敏度高&定位准确!定位长度在JP=ABCD可同时检测多种序列!应用范围极其广泛#JFNABCD技术主要步骤ABCD主要操作流程如图JFOABCD技术的发展目前ABCD技术经过不断的丰富和完善!已经形成多色荧光原位杂交$R659&8’5’+456’+0780*80ABCD%&基因组原位杂交$20*’R07&9676I!I+077&’*S%BCD%等一系列新技术#JFOFJ多色荧光原位杂交多色荧光原位杂交技术的最大特点就是可利用不同颜色的荧光分子标记不同的探针!同时对不同的靶在同一标本上进行定位!即一次杂交检测多个靶位#于不同荧光分子的光谱重叠!一般只能同时使用为扩大ABCD容量!近年来发展了组合标记&比例标记&多色染色体涂色等方法标记更多探针#JFOFN纤维:荧光杂交技术鉴于ABCD技术分辨率低等问题!/-.纤维:ABCD技术利用化学方法对染色体进行线性化!改变染色质原有空间结构!降低浓缩程度!从而提高ABCD分辨率#与普通ABCD术相比!/-.纤维:荧光杂交技术具有分辨率和灵敏度高!可直接确定不同定量分析等优点#JFOFO基因组原位杂交原位杂交技术直接利用特异性作为分子探针!可对近亲缘性关系的分类群之间基因组关系进行研究!也可直接利用全部基因组作为探针!从而鉴定动植物全部的亲本基因组!该技术快速&灵敏&准确#ABCD在环境微生物分子生态中的应用已有的微生物群落结构&功能&分布及其生态学等研究结果仅表明混合菌群具有较高的生物多样性!但只有非常少的微生物被分离和鉴定!而只有了解微生物单一菌株功能特性&混合菌群多样性以及微生物结构的形成特性!才能提高对环境处理系统的控制能力#因此!结合ABCD技术用于环境微生物的研究!可用以研究环境微生物生态系统的组成&结构与功能!尤其是具有特殊分层结构&多样化代谢菌群共存!杭州职业技术学院浙江杭州结合#能将微生物检测$鉴定到属和种的水平#具有测定过程不破坏细胞及其形状$特异性强$分辨率高$安全$快速等特点%在环境微生物群落结构分析中#已被逐渐应用于絮状活性污泥$颗粒污泥等微生物种群和群落分子生态研究中%关键词!荧光原位杂交环境微生物分子生态颗粒污泥中图分类号!3$&/文献标识码!4文章编号!$%&/()5%+’55%#5-(55-+(5’作者简介!江平!!./.0#男#杭州职业技术学院化学工程系助教%研究方向&环境污染治理及生物修复%与协同偶合等特性的颗粒污泥!对于深层次了解环境微生物种群关系群落结构与处理效率的相关性!进一步提高废水处理效率具有重要的理论和实用意义#对硝化细菌的研究硝化菌和氨氧化菌的数量及空间分布与微生物在硝化(反硝化过程中所处的阶段相关!因此对生物处理系统中硝化菌及氨氧化菌的研究是调控废水脱氮工艺运行的重要参数$于硝化细菌是一类生理上非常特殊的化能自氧菌!传统的研究方法要经过富集%分离分类和鉴定步骤!耗时长!且因所用的培养基有选择性使得某些易于培养的菌株!如)*+,-.-/-01.23,-4121)*+,-516+2,7*0-8,19.:;*等超过了其他硝化细菌!使得到的优势类群与样品真实情况有差异$技术应用于硝化细菌检测!并建立了一套较完善的硝化细菌检测方法!之后随着人工设计合成的硝化细菌及氨氧化菌探针的不断推出!$%&’技术被广泛地应用于活性污泥系统硝化流化床反应器和膜生物反应器等污水处理系1@A!BB!C对硝化流化床普通活性污泥等工艺的活性污泥中硝化细菌的多样性采用法进行了跟踪分析!发现)*+,-516+2,!在对多个工业废水处理厂利用活性污泥工艺处理工业废水的探测中发现D)*+,-.-/-01.氨氧化菌EFG%染色总菌数的HIJ!KJ!探针&LMNL)+.41LHB!IL1LFLHO检测到的硝化细菌占细胞总数的PJ$考虑到颗粒污泥的特殊结构特性!具有一定粒径的颗粒污泥由于氧扩散梯度的存在!其内部形成缺氧或厌氧区域!因此在好氧条件下构成了有利于同步硝化反硝化的微观环境!加上序批式反应器独特的厌氧(兼氧L好氧交替反应!可在颗粒污泥外层和内部同步实现硝化和反硝化$因此!近年来1@A!BBMR通过ESST标记的TW=MMO%QX%QU标记的)&YHPB$%QU标记的)%QM等作为探针’对好氧流化床反应器&FW$=’内硝化颗粒污泥的分析发现!氨氧化菌作为颗粒污泥内优势菌!主要分布于颗粒外层!同时在颗粒表面存在少量亚硝酸盐氧化菌$对除磷细菌的研究脱氮除磷工艺在废水处理工程中被广泛应用!特别是强化除磷AT=GXR工艺!对污水除磷效果十分显著$近年来!国内外许多学者利用分子杂交技术对不同除磷工艺中聚磷菌的生态变化进行了大量研究$技术的应用克服了以往除磷菌难以用常规方法培养造成的研究上的困难!并对不同条件下生物除磷工艺的改进起到了指导性的作用$Z1/-,3对强化除磷AT=GXR工艺的研究中!无论好氧或厌氧区的活性污泥中都存在丰富的除磷微生物D其中常见类群为1@&!BBM’报道了在厌氧L好氧交替运行的反应器内形成了与生物除磷有关的聚糖原菌6-8201663/3@1+*08-,810*./.’颗粒污泥!TW=Z%[A细菌R%SFY\Z%[AU-/42+*516+2,R为探针的分析结果表明!U-/42+*516+2,分布于整个污泥颗粒!但 其代谢活性主要分布在颗粒表层 HBB!/ 范围内$ 对难降解有机物功能降解菌的研究近年来D国内外许多学者利用分子杂交技术对不同功能降解 菌的生态变化进行了一定研究!$%&’ 技术的应用克服了功能降 解菌用常规方法培养困难的问题$ *108 1@_!BB‘R对&=X反应器 内好氧颗粒污泥苯酚降解菌群分布进行了研究!$%&’LU]&Z 果阐明好氧颗粒污泥内GSLBH 菌株的丰度和空间分布! 通过 $%QU 标记 TW=MMO 探针%QX%QU 标记 FXU’PHV 探针和 记G109O!!探针在颗粒外表面!B!/ 范围内的$%&’ 结果表明! 颗粒具有致密的外表面!内部较为疏松!$%&’ 结果表明颗粒完全 由细菌细胞组成!与TW=MMO 探针杂交的细菌分布与整个颗粒区 域!通过FXU’PHV 探针杂交未检出古细菌! G109O!! 探针杂交 表明颗粒内部存在一定数量的GSLBH 球菌! 多数GSLBH 细胞分 布在颗粒的外表层!内部有少量GSLBH 细胞存在$ 结论与展望尽管 技术应用于环境微生物群落分子生态研究中还存在一些问题!如荧光信号弱%分辨率不高!对某些细胞壁 穿透性差%生长缓慢的微生物细胞难以检测到等!但相信随着 分子生物学技术和精密仪器设备研制技术的不断发展!$%&’ 技术将会具有更强的可操作性和实用性!并且随着新探针A如 厌氧菌探针R的开发!将应用到更多的环境微生物分子生态系 统研究中!尤其是具有特殊结构的颗粒污泥菌群组成%结构% 分布的研究中!对于深入%完整地进行环境微生物分子生态学 理论研究具有重要的理论和现实意义$ 参考文献! U-/5*0*08a@3-,2.620+ .*+3?;5,*9*b1+*-0 63@+*c1+*-0109 /1+?2/1+*61@ /-92@*08 .+39;4-43@1+*-0 .+,36+3,2 109 a306+*-0 1//-0*1L-d*9*b*08516+2,*1 16+*c1+29.@3982 109&2c*-3, E2.*80109 144@*61+*-0 -@*8-036@2-+*924,-52. .*+3*920+*a*61+*-0 a*@1/20+-3.516+2,*1@ /-,4?-+;42 0-.+-6-*91 @*/*6-@1 16+*c1+29.@3982^ T0c*,-0^ Z*6,-5*-@^ !BBH AMRfVV IB =16+2,*1@E*c2,.*+; 109 $306+*-0

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